還原糖含量試劑盒說明書 |
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還原糖含量試劑盒說明書 可見分光光度法 正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定 測定意義： 還原糖廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中。植物體內(nèi)的還原糖主要包括葡萄糖、果糖和麥芽糖等，是zui常見的單糖和雙糖，其中葡萄糖和果糖不僅是呼吸作用的主要底物，也是進一步合成蔗糖、淀粉和纖維素的底物。 測定原理： 加熱促進堿性溶液中 3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖生成棕紅色氨基化合物，在540nm 有特征吸收峰；在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖含量與540nm吸光度成線性關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出樣品中還原糖的量。 需自備的儀器和用品： 可見分光光度計、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、蒸餾水。 試劑的組成和配制： 試劑一：100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：20mL×1 瓶 ，4℃保存； 樣品中還原糖的提取： 1、細菌或細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議1000萬細菌或細胞加入2mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次），轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時水分散失），80℃水浴中40min 并且振蕩8~10 次，8000g，25℃離心 10min，取上清供測定用。 2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.2g 組織，加入2mL試劑一），冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時水分散失），80℃水浴中40min 并且振蕩8~10次，8000g，25℃離心10min，取上清供測定用。 3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（mL）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建 議取0.2mL血清（漿）加入2mL試劑一），冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時水分散失），80℃水浴中 40min 并且振蕩 8~10 次，8000g，25℃離心10min，取上清供測定用。 測定步驟： 1、 分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm，蒸餾水調(diào)零。 2、 調(diào)節(jié)水浴鍋至 95℃。 3、 在 EP 管中加入下列試劑：
將各管搖勻，在 95℃水浴中加熱 5min（蓋緊，防止水分散失），取出后立即冷卻至室溫， 混勻。在 540nm波長下讀取對照管和測定管吸光值。計算 ΔA=A 測定-A 對照。 注意：1、每個測定管需設(shè)一個對照管。 2、如果 ΔA大于2，需要將樣本用試劑一稀釋，計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。 還原糖含量計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y =8.5067x-2.0807；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。 2、按樣本鮮重計算： 還原糖 (μg/g 鮮重 )=[1000×(ΔA＋2.0807)÷8.5067×V1]÷(W×V1÷V2) =235×(ΔA ＋2.0807)÷W 3、按樣本蛋白濃度計算： 還原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA＋2.0807)÷8.5067×V1]÷(V1×Cpr) =117.55 ×(ΔA＋2.0807)÷Cpr 4、按細菌或細胞密度計算： 還原糖(μg/104cell)=[1000×(ΔA＋2.0807)÷8.5067×V1]÷（1000×V1÷V2） =0.235×(ΔA＋2.0807) 5、按血清（漿）體積計算： 還原糖(μg/mL)=[1000×(ΔA＋2.0807) ÷8.5067×V1]÷（V3×V1÷V2） =1175.5×(ΔA＋2.0807) 1000：1mg/mL=1000µg/mL；V1：加入樣本體積，0.7mL；V2：加入提取液體積，2 mL；V3：加入血清（漿體積），0.2mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；1000：細菌或細胞總數(shù)，1000 萬。 注意：低檢測限為 1mg/g 鮮重或 10μg/mg prot |
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