葡萄糖含量試劑盒說明書 |
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葡萄糖含量試劑盒說明書 微量法 正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定 測定意義： 葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物，而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物。植物可通過光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動物而言，葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組 織等的WEI一能源，而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān)。 測定原理： 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過氧化氫；過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在 505 nm 有特征吸收峰。 需自備的儀器和用品： 可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽和蒸餾水 試劑的組成和配制： 試劑一：0.5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 10ml×1 瓶，4℃保存； 試劑三：液體 10ml×1 瓶，4℃保存； 葡萄糖提取： 1、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），研磨成勻漿，冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次后，8000g，25℃離心10min，取上清液備用。 2、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：蒸餾水體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL蒸餾水），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次），95℃水浴10分鐘（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，8000g，25℃離心 10min，取上清液備用。 3、其他類液體，離心后可直接取上清檢測。 測定步驟： 1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至505nm，蒸餾水調(diào)零。 2、混合試劑的配制：使用前將試劑二和試劑三1:1等體積混合，用多少配多少。 3、加樣表（在EP管或96孔板中加入下列試劑）：
混勻，置 37℃（哺乳動物）或 25'C（其它物種）保溫 15min 后，于 505nm 波長處讀取吸光 度。空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管吸光值分別記為 A1、A2 和 A3。空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。 葡萄糖含量計算： 1、按樣本蛋白濃度計算 葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr) =0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷Cpr。 2、按樣本鮮重計算 葡萄糖含量（µmol/g 鮮重）= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2) =0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷W 3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算 葡萄糖含量（µmol/104cell)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2) =0.001×(A3-A1)÷(A2-A1) C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5µmol/mL；V1：加入樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。 注意：低檢測限為 50nmol/g 鮮重或 0.5nmol/mg prot
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