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馬外周血NK細胞分離液試劑盒

Store at：：：RT 試劑盒規(guī)格：：：：3×100ml/Kit

試劑盒內(nèi)容：

全血及組織稀釋液 100ml

細胞洗滌液 100ml

試劑 B 100ml

試劑 D 100ml

試劑 E 100ml

說明書 1 份

馬外周血NK細胞分離液試劑盒

1. 適用于各種動物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索

2. 相關(guān)試劑及耗材

3. 注意事項

4. 應(yīng)用

5. 產(chǎn)品性能指標

6. 貯藏及保存期限

7. 實驗前準備

8. NK 細胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例

9. HES-TBD550 使用說明

10. 組織單細胞懸液的制備

11. 生產(chǎn)企業(yè)

12. 參考文獻

2. .. 注意事項 A． 本分離液是敏光型的，在運輸和貯藏過程中應(yīng)在 18℃-25℃避光保存，啟封后置 4℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

B． 待分離的血液、組織及細胞要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一

定在20℃水浴箱中復(fù)溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時分離效果，

且所有操作過程一定要在無菌條件下進行。

C． 由于各品牌離心機的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響

分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時間，摸索*的分離條件（具體分離條件

各實驗室自定）。

D． 使用無靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。

E． *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。應(yīng)注意在血液稀釋過程中應(yīng)去除抗凝劑

體積。

 F． 分離過程中所用其他試劑如：羥乙已基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細胞洗滌液及

紅細胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇，本公司相關(guān)系列產(chǎn)品無菌、無病毒、無支原體、

低內(nèi)毒素水平且無細胞毒性，所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態(tài)。

4. .. 應(yīng) 4. 用

適用于從人或各種動物血液或臟器組織中分離 NK 細胞。

5.. . . 產(chǎn)品性能指標

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內(nèi)毒素 ≤0.5...EU/ml

無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

6.. . . 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限

18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置 4℃保存，有效期一周。

注：：：：若保證無微生物污染，啟封后可置 4℃長期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

7. .. 實驗前準備 7. 實驗前準備

A． 試劑

NK 細胞分離液試劑盒所含試劑、組織勻漿液、胎牛血清

B． 器材 玻璃離心管、玻璃滴管 水平轉(zhuǎn)子離心機、無菌工作臺

A. 在 10ml 或 15ml 玻璃離心管中依次小心加入 B、D 兩種液體各 2ml,制成梯度界面（各液面分層一定要清晰）；

B．取 1ml新鮮抗凝血或組織單細胞懸液（細胞濃度為2×108

-1×109個/ml，具體制備方法參照“10.組織單細胞懸液的制備”）與試劑E 1：1混合后再按2:1的比例與全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）混勻。20℃-30℃靜置20-30分鐘，吸取上層渾濁液備用，棄去大部分紅細胞；

C．將步驟B中吸取的上層渾濁液小心加于D液之液面上；

D. 以400g（約1500轉(zhuǎn)/分）離心15分鐘(半徑15cm水平轉(zhuǎn)子)；

此時離心管中由上至下細胞分為四層。*層；為上清液層（包含血小板和血漿）。第

二層；；；；為 NK 細胞層。。。。第三層；為渾濁分離液層（含大量 T、B 及粒細胞）。第四層；為極少量紅細胞層。收集第二層 NK 細胞放入含 4-5ml 細胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20 分鐘，棄去上清留沉淀細胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需 NK 細胞。

注：：：：A. 提取率約為 80%。

 B．分離大量樣品時，具體操作方法請參照我公司“淋巴細胞快速分離技巧”，查詢路徑：

HES 是從支鏈淀粉衍生出來的，是富含淀粉的復(fù)合物，其生理和化學(xué)特性主要由羥乙已基

取代度即取代級、平均分子量決定。大量實驗表明平均分子量越大對紅細胞的凝集作用越強，

有效提高紅細胞的沉降速度，從而使紅細胞與其它細胞分離。故而，使用 HES-TBD550（羥

乙基淀粉 550）沉淀法是一種高效的細胞分離方法。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨細胞、成脂肪細胞、

骨髓基質(zhì)細胞、肝臟細胞、心肌細胞和神經(jīng)細胞等多種細胞分化的多潛能組織干細胞,是在

細胞治療、基因治療中有效發(fā)揮作用的理想工程細胞。MSCs 不僅存在于骨髓,也可從臍血、

外周血中以及脂肪組織、肌肉、胎兒器官、大腦、牙齒中分離。UCB - MSCs 的分離、篩選、

增殖、分化與臍血樣本的選擇、培養(yǎng)基的差異以及分離、擴增分化過程中操作技術(shù)等多種因

素有關(guān)。目前用于 UCB - MSCs 分離的方法有:貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀

法和免疫磁珠法。流式細胞儀法對細胞損傷較大，免疫磁珠法價格相對較貴且由于抗原抗體

反應(yīng)也容易改變細胞原有特性，而 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法常與貼壁篩選法結(jié)合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的純度，目前研究多采用此法。國內(nèi)不少學(xué)者采用羥乙已基淀粉沉淀紅細胞，然后再進行離心分離單個核細胞，也取得不錯結(jié)果。實驗證明采用隨機數(shù)字表法，將每份臍血隨機分入兩個不同處理組，從而將臍血樣本的個體差異減小到zui小程度。結(jié)果證實，HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法獲得的有核細胞數(shù)量明顯多于 FICOLL 密度梯度離心法。本實驗采用的羥乙已基淀粉商品名為

HES-TBD550（羥乙已已基淀粉 550），克分子滲透壓為 308mosm／L，膠體滲透壓為 68／36 mmHg,可影響紅細胞集聚性沉降率。紅細胞集聚是可遞性橋接結(jié)構(gòu)形成的結(jié)果，由大的 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）分子處在紅細胞之間聯(lián)接而成。HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）同時還阻礙白細胞和內(nèi)皮細胞的黏附，并使平均血小板容積呈現(xiàn)微弱地降低，從而有輕度抑制血小板集聚的功能。臍血經(jīng) HES-TBD550（羥乙一基淀粉 550）處理后，可使紅細胞沉積至試管底，對其它主要成分包括干細胞無影響。經(jīng)這樣處理后，實驗時間相對較短（平均為 1.5 h），步驟相對較少，細胞污染幾率小，從而使細胞數(shù)損失減少。結(jié)論證明，與相應(yīng)的干細胞分離液聯(lián)合分離使用羥乙已基淀粉沉淀法是一種高效的臍血干細胞分離方法。

10.. . . 組織單細胞懸液的制備

注：：：：A.. .. 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法，，，，酶消化法由于各實驗室選取的消化 酶消化法由于各實驗室選取的消化

酶種類各不相同，，，，請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗。。。。

B. .. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 B. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境。。。。

剪碎法：：：：將組織塊放入平皿后，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至

勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)

(另購)過濾到試管內(nèi)；離心沉淀 1500轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細胞洗滌液清洗 3次，每次以 500rpm

短時低速離心除去細胞碎片，以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾去細胞團塊。作細胞計數(shù)并

調(diào)整細胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用 20%胎牛血

清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108

-1×109個/ml 的單細胞懸液備用。

勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nèi)，加入 2ml 組織勻漿液及 20% 勻漿器法

胎牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器；收集

細胞懸液，經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細胞洗滌液

洗 3 次，離心沉淀。作細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測

細胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108

-1×109 個

/ml 的單細胞懸液備用。

細胞計數(shù)法是用來計數(shù)細胞懸液中細胞數(shù)量的一種方法。一般利用計數(shù)板（血球計數(shù)板）

進行。既可用于分離（散）細胞培養(yǎng)接種前計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，也可用于

對培養(yǎng)物的細胞數(shù)量進行計數(shù)。不論計數(shù)的對象如何，均須制備分散的細胞懸液。

計數(shù)與計算過程

1）、在細胞計數(shù)板中央放置計數(shù)的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹蹧處流出懸液，至

蓋玻片被液體充滿為止。

3）、置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細胞總數(shù)。對于壓線的細胞只計數(shù)在上線和左線者，

對于細胞團按單個細胞計數(shù)。

4）、按下式計數(shù)細胞懸液的密度：

細胞密度＝（4 個大格細胞總數(shù)/4）×104個/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

 而 1ml＝1000mm3

細胞計數(shù)要點： 細胞計數(shù)要點：：：

A． 進行細胞計數(shù)時，要求懸液中細胞數(shù)目不低于 104個/ml，如果細胞數(shù)目很少要進行離

心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計數(shù)時，遇到 2 個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細

胞計算。如果細胞團>10％，說明細胞分散不充分; 或細胞數(shù)<200 個/10mm2或>500 個/10 mm2

時，說明稀釋不當，需重新制備細胞懸液。

B． 要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性。

C． 取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細胞懸液，尤其是多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混

勻，以求計數(shù)準確；

D． 數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細

胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。

E． 操作時，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯誤： 初學(xué)者易犯的錯誤：：：

A． 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。

B． 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C． 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

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